BAC/BIBAC/Fosmid

本实验室有丰富的BAC及BIBAC等文库构建的经验（参见PI简历和发表的文章，所有文章都可以从本网站下载），构建过包括脊椎/无脊椎动物、单/双子叶植物和微生物在内的大量BAC文库。

本实验室采用自己构建的载体pIndigoBac536-S [2]和自己建立的方法[3]构建文库。该载体采用蓝白斑筛选，从而能有效减少空载；在载体插入位点两侧具有18碱基的超稀有酶切位点I-SceI，从而几乎所有BAC克隆用此酶切下的插入片段都只有一条带，使得该载体具有以下优点：

文库插入片段大小的检测简单而又精确；
完整大片段DNA的回收和在不同载体之间的交换都非常方便；
末端测序后，插入片段可作为精确的“卡尺”用来检测基因组序列组装的正确性；
保存在384板上的克隆的双克隆或多克隆污染能非常容易地被鉴定出来。如果一个样品被I-SceI酶切出两条都接近平均插入片段大小的带，则该样品极有可能是双克隆污染。BAC文库克隆交叉污染的可能性和严重性在Schulte D等（Schulte D et al., BMC Genomics 2011, 12:247）和我们的文章中[2]都有详细的讨论

BAC物理图谱制作和全基因组测序

没有物理图谱作框架的第二代全基因组序列拼装非常困难。我们发明了一种方法，已获得发明专利（201310288791.8），其简要流程如下：

构建BAC文库，构建多维BAC克隆DNA混合池，进行第二代测序，将序列按多维交集点定位到BAC克隆上，根据重叠的BAC序列将BAC克隆整合成物理图谱。

与原有BAC物理图谱制作方法相比，我们的方法有如下特点：

高效、简便、经济、性价比高，使得构建物理图谱的花费在可承受范围内。
不依赖酶切位点，分辨率高。原有方法依赖酶切位点，但酶切位点数量有限，且并非平均分布，同时受实验条件、反应体系、酶切片段长度估算和实验操作等诸多因素影响（如星活性或不完全酶切），并且一般每次只能用一种酶，而我们用的是任何序列。
我们方法可同时获得物理图谱和与物理图谱整合的序列草图，其上的序列可作为锚定点与其它任何方法产生的序列整合，这特别适合已用二代测序但组装困难的基因组，也就是说不会使已有二代序列浪费。
因为序列先归到了BAC克隆上，对杂合基因组的组装有利。

与光学物理图谱相比，我们方法制作的物理图谱有如下特点：

光学物理图谱基于酶切位点，存在除上述第2点提到的问题外，如果直接用基因组DNA实验还有DNA甲基化等修饰引起的问题，而我们的物理图谱不依赖酶切位点。
光学物理图谱只能用于对已拼装的序列作初步验证（不能作最终确定，因为根据的是有限的酶切位点和酶种类而不是序列信息），我们的BAC物理图谱则用于指导序列拼装，而全基因组测序的难点正是拼装。
BAC物理图谱指导下的测序大大降低了基因组的复杂度，对复杂基因组测序，BAC物理图谱起着光学物理图谱无可比拟的作用。
光学物理图谱无实物，不能帮助完成序列，而我们的物理图谱为通过定向测序、补缺或整合同一基因组其它来源的序列最终完成参考序列级的全基因组序列提供框架和DNA模板。

BAC克隆测序

构建BAC克隆的shotgun文库，利用Sanger测序方法进行测序，再利用PCR方法进行补缺，组装获得目标BAC克隆的完整插入序列。

BAC末端测序

我们有两种BAC末端测序技术：

1.传统一代Sanger BAC末端测序

我们实验室拥有成熟的一代Sanger BAC末端测序技术及平台，BAC末端序列（BES）长度平均达到700 bp。主要用途：

BAC双末端序列结合插入片段精确的长度信息用于检测基因组序列组装的正确性；
用于文库筛选后所得目的BAC克隆的末端测序；
用于文库中叶绿体、线粒体和细菌DNA污染情况检测等。

2.高通量全基因组成对长BAC末端测序

我们实验室最近建立了一种新方法，能得到批量的、成对的、很长的BAC末端序列。主要用途：

用于全基因组序列拼装和验证；
用于比较基因组研究；
双末端定位后的BAC克隆可用于全基因组序列补缺或功能研究。

BAC 指纹图谱制作

本实验室拥有成熟的BAC指纹图谱制作技术及平台。

BAC文库混合池建立及克隆筛选

建立BAC文库384孔板、行和列不同级别混合池，利用质粒或菌液PCR的方法筛选目标克隆。

本实验室发表和参与发表的有关BAC文库构建及应用的文章

Chao Wang et al. (2013)Genetics 195: 723 - 737
Xue Shi et al. (2011) Plant Methods 7: 33
Meizhong Luo and Rod Wing (2003) Methods in Molecular Biology 236: 3 - 19
Xiaoming Wang et al. (2014) Genetics 196: 937 - 949
Yonglong Pan et al. (2014) Plant Journal 77: 795 - 805
Ying Deng et al. (2014) Plant Biology 16: 643 - 650
Xiaoming Wang et al. (2013) BMC Genomics 14: 883
刘庆丽等（2013）微生物学通报40: 1715 – 1722
Haiyan Lin et al. (2012) Mol Plant 5: 218 - 230
Andrea Zuccolo et al. (2011) Genome Biology 12:R48: 1 - 14
Xiang Song et al. (2011) Genetics 187: 1023 - 1030
毛丹青，罗美中（2010）中国农业科技导报12: 103 – 107
Steve Rounsley et al. (2009) Rice 2: 35 - 43
Peter J. Maughan et al. (2008) Plant Genome 1: S85 - S94
William Nelson et al. (2008) BMC Genomics 9
Haiying Liang et al. (2007) Tree Genetics and Genomes 3: 215 - 225
Drosophila 12 Genomes Consortium (2007) Nature 450: 203 - 218
Jetty S.S.Ammiraju et al. (2006) Genome Research 16: 140 - 147
Meizhong Luo et al. (2006) Genomics 87: 181 - 190
Yann-Rong Lin et al. (2006) Plant Science 170: 889 - 896
Meizhong Luo et al. (2006) BMC Genomics 7
Coen M Adema et al. (2006) Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro 101: 167 - 177
Barbara L Hass-Jacobus et al. (2006) BMC Genomics 7
Rod A. Wing et al. (2005) Plant Molecular Biology 59: 53 - 62
Elliott H. Margulies et al. (2005) PNAS 102: 3354 - 3359
Wenming Wang et al. (2005) BMC Plant Biology 5
The rice chromosome 3 sequencing consortium (2005) Genome Research 15: 1284 - 1291
IRGSP (2005) Nature 436: 793 - 800
Mingsheng Chen et al. (2002) Plant Cell 14: 537 - 545
Jeffray P. Tomkins et al. (2002) Genet Mol Res 1: 306 - 316
Wenming Wang et al. (2001) Mol Gen Genet 265: 118 - 125
Meizhong Luo et al. (2001) Genome 44: 154 - 162